梅毒pcr检测怎么看(pcR检查是什么意思)

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聚合酶链式反应测试是什么意思？什么是pcr检测定量PCR技术？有广义和狭义的概念。广义的定量PCR技术是指以外部或内部参照为标准，通过分析最终PCR产物或监控PCR过程，对PCR的初始模板量进行定量。广义上的定量PCR技术可分为五种：(1)外参法分析终产物。所谓“外参法”是指样品与阳性参比在两个反应容器中反应。这类样本不进行质控监测，容易出现假阴性和假阳性结果，扩增效率不监测，定量不准确。(2)内参法最终产品的分析。所谓“内参法”是指样品在反应容器中与阳性参比反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴性结果，但定量不准确。(3)外标法过程监控。该类型监测扩增效率，阳性样本定量准确，但不能排除假阴性结果。(4)内部参考过程监控。因为样品与阳性参照在同一容器中反应，使用相同的Taq酶和反应参与者，所以存在竞争性抑制。初始模板浓度高的反应会抑制初始模板浓度低的反应，所以定量不准确。(5)外部标准流程监控内部控制。这种类型监测扩增效率，准确定量阳性样品，并排除假阴性结果。这种类型应该提倡。监控PCR过程有多种检测模式。常用的检测模式有三种：(1) Rgreini检测模式。循环温度为94—55—72三步法，只有引物，没有探针，荧光染料包埋在双链螺旋链中间。通过在特定方向上的强荧光检测获得信号。这种试剂检测模式容易产生非特异性信号，背景光大。(2)两步法，温度循环为94-60 ,探针解链模式，不仅使用引物，还使用另一种对引物对之间的扩增模板特异的探针。两种荧光染料分别键合在探针的两个相邻碱基上，一种染料接收激发光得到的能量传递给第二种染料，第二种染料接收能量通过发射特征光子回到稳定状态。当Taq酶在60下延伸扩增链时，它与探针相遇，探针被Taq酶的5’—3’核酸外切酶活性水解成单个碱基。单碱基之间的距离较远，第一种染料的能量无法转移到第二种染料上，所以它必须发射特征光子才能回到稳定状态，信号是通过荧光检测溶液中的第一种染料得到的。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但由于使用了Taq酶的5—3核酸外切酶活性，一般试剂生产厂家只校准Taq酶的聚合酶活性，而不同时校准Taq酶的5—3核酸外切酶活性，这将导致不同批次试剂之间的定量差异。另外，只要求探针的熔点温度(Tm)高于60，这使得不同试剂盒的特异性参差不齐，无法用于质控检测。(3)杂交探针模式。循环温度为94-55-72的三步法，使用引物，引物对之间有两个对扩增模板特异的探针，一个探针在3’碱基与荧光染料结合，另一个探针在5’碱基与第二种荧光染料结合。在55下，两种探针都刚好结合到模板上，第一种染料接收激发光所获得的能量被转移到第二种染料上。接收能量的第二染料通过发射特征光子返回到稳定状态，并且通过结合到扩增模板的双探针中的第二染料的荧光检测获得信号。在这种试剂检测模式下，荧光信号与特定的杂交温度有关，探针的浓度始终保持恒定，因此可以在扩增后检测解链曲线，作为信号的特定质控。此外，这种试剂检测模式可用于点突变检测

理论上，只要有一个拷贝数，样本就是阳性的；没有拷贝数是负数。

什么是PCR？聚合酶链式反应(PCR)是20世纪80年代中期开发的体外核酸扩增技术。它具有特异、灵敏、高产、快速、简便、重复性好和易于自动化等突出优点。待研究的目标基因或某个DNA片段，可以在试管中放大到10万倍甚至百万倍，肉眼可以直接观察判断；可以从一根头发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足够的DNA，用于分析、研究、检测和鉴定。过去几天和几周才能完成的事情，通过PCR可以在几个小时内完成。PCR技术是生物医学领域的革命性创举和里程碑。

PCR技术简史

PCR最早的想法是核酸研究已经有100多年的历史了。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究体外基因分离技术。Korana于1971年首次提出了体外核酸扩增的思想：“DNA变性后，用合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复这一过程，即可克隆出tRNA基因”。

PCR的实现1985年，美国PE-塞特斯公司人类遗传学实验室的穆利斯等人发明了划时代的聚合酶链式反应。其原理类似于体内的DNA复制，只是在试管中提供了体外合成DNA的合适条件——模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲体系、DNA变性、复性和延伸的温度和时间。

PCR的改进和完善：Mullis最开始用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，缺点是：Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次都要重新加入。引物扩链反应在37进行，容易出现模板与引物的碱基错配。PCR产物特异性差，合成的DNA片段参差不齐。虽然这种Klenow酶催化的PCR技术与传统的基因扩增相比有很多突出的优点，但是Klenow酶不耐热，当DNA模板热变性时，这种酶就会钝化，每次加酶只能完成一个扩增反应循环，这就给PCR技术的操作程序增加了很多难度。这使得PCR技术在一段时间内未能在生物医学领域引起足够的重视。1988年初，Keohanog使用T4 DNA聚合酶进行PCR，扩增出的DNA片段非常均匀真实，只有一个预期的DNA片段。然而，在每个周期之后，仍然需要添加新的酶。1988年，斋祀等人从温泉中分离出的嗜热菌中提取了一种热稳定的DNA聚合酶。该酶具有以下特点：耐高温，70下2小时后剩余活性大于90%，93下2小时后剩余活性大于60%，95下2小时后剩余活性大于40%。在热变性过程中不会被钝化，每次扩增反应后无需添加新的酶。大大提高了扩增片段的特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。因为扩增的特异性和效率提高了，它的灵敏度也大大提高了。该酶被命名为Taq DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)，以区别于大肠杆菌聚合酶I Klenow片段。这种酶的发现使得PCR得到广泛应用。

PCR技术的基本原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的自然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤组成：模板DNA的变性：将模板DNA加热到93左右一定时间后，模板DNA的双链DNA或PCR扩增的双链DNA解离，使其与引物结合，为下一步反应做准备；模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA加热变性为单链后，降温至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对；引物的延伸：DNA模板——在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，以靶序列为模板，根据碱基配对和半保守复制的原理，合成一条与模板DNA链互补的新的半保守复制链。通过重复循环变性-退火-延伸三个过程，可以获得更多的“半保守复制链”，这个新链可以作为下一个循环的模板。完成一个循环需要2 ~ 4分钟，目的基因扩增几百万次需要2 ~ 3小时。达到平台所需的循环次数取决于样品中模板的拷贝数。

PCR的反应动力学重复PCR的三个反应步骤，DNA扩增的量呈指数增长。最终的DNA扩增可以通过y=(1+x) n来计算.y代表扩增后DNA片段的拷贝数，X代表每次的平均扩增效率，N代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中，平均效率没有达到理论值。在反应的初始阶段，靶序列的DNA片段的增加是指数级的。随着PCR产物的逐渐积累，扩增的DNA片段不再呈指数增长，而是进入线性增长期或平稳期，即出现“停滞效应”。这种效应称为平台期的数目、PCR的扩增效率、DNA聚合酶PCR的类型和活性以及非特异性产物的竞争。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

PCR产物可分为两部分：长产物片段和短产物片段。短产物片段的长度严格限制在两条引物链的5’端之间，是待扩增的特异性片段。短产物片段和长产物片段是由于引物结合的模板不同而形成的。以一个原创模板为例。在第一个反应循环中，两个互补的DNA被用作模板。引物从3’端延伸，它的5’端是固定的，但3’端没有固定的终止子，所以长度不同。这就是所谓的“长产品碎片”。进入第二个循环后，引物不仅与原来的模板结合，还与新合成的链结合(即“长产物片段”)。当引物与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就意味着延伸片段的3’端也是固定的，这就保证了新片段的起点和终点都被限定在引物扩增序列内，形成一个长度相同的“短产物片段”。不难看出，“短产品碎片”是指数级增长，而“长产品碎片”是算术倍数增长，几乎可以忽略不计。这使得PCR的反应产物不需要再次纯化，从而保证有足够纯的DNA片段用于分析和检测。

PCR反应系统和反应条件

标准PCR反应系统：

10倍扩增缓冲液10ul

四种dNTP混合物中的每一种为200 m ol/L

每道底漆10-10~100pmol。

模板DNA 0.1 ~ 2 ug

Taq DNA聚合酶2.5u

镁1.5毫摩尔/升

添加双份或三份蒸馏水至100微升。

PCR反应五要素：参与PCR反应的物质主要有五种，分别是引物、酶、dNTP、模板和Mg2。

引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA的互补程度。理论上，只要知道模板DNA的任意序列，就可以根据它设计互补的寡核苷酸链作为引物，通过PCR在体外扩增模板DNA。

引物s

避免引物中的二级结构，避免两个引物之间的互补，尤其是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性扩增带。

引物3’端的碱基，尤其是最后一个和倒数第二个碱基，要严格配对，避免末端碱基错配导致PCR失败。

可以在引物上添加合适的限制性位点，扩增的目的序列要有合适的限制性位点，这对限制性分析或分子克隆非常有利。

引物的特异性：引物应与核酸序列数据库中的其他序列无明显同源性。

引物量：每种引物的浓度为0.1 ~ 1 umol或10 ~ 10~100pmol。最好用最少的引物量产生所需的结果。高引物浓度将导致错配和非特异性扩增，并增加引物之间形成二聚体的机会。

目前可用的Taq DNA聚合酶有两种，一种是从嗜水气单胞菌中纯化的天然酶，另一种是大肠杆菌合成的基因工程酶。催化一个典型的PCR反应需要约2.5U的酶(当总反应体积为100ul时)。浓度过高会引起非特异性扩增；如果浓度太低，合成产物的量会减少。

dNTP的质量和浓度与浓度和PCR扩增效率密切相关。dNTP粉末呈颗粒状，保存不当会失去生物活性。DNTP溶液呈酸性，使用时应配制成高浓度，然后加入1M NaOH或1M Tris。HCL缓冲液调节其PH值至7.0 ~ 7.5，分装成小量，冷冻于-20。反复冻融会降解dNTP。在PCR反应中，dNTP的浓度应在50 ~ 200 umol/L，尤其是四种dNTP的浓度应相等(等摩尔配制)。如果其中任何一个的浓度与其他不同(高或低)，就会造成不匹配。如果浓度太低，PCR产物的产量会降低。DNTP可以与Mg2结合以降低游离Mg2的浓度。

模板(靶基因)核酸模板核酸的数量和纯化程度是PCR成败的关键环节之一。传统的DNA纯化方法通常使用SDS和蛋白酶K来消化和处理样品。SDS的主要作用是：溶解细胞膜上的脂质和蛋白质，从而溶解膜蛋白破坏细胞膜，解离细胞内的核蛋白。SDS也能与蛋白质结合，沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，然后用有机溶剂苯酚和氯仿提取蛋白质和其他细胞成分，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸可以用作PCR反应的模板。对于临床标本，可采用快速简便的方法裂解细胞，裂解病原体，消化去除染色体的蛋白质以游离目的基因，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，防止RNA酶降解RNA。

Mg2的浓度对PCR扩增的特异性和产量有显著影响。在一般的PCR反应中，当dNTP的浓度为200umol/L时，Mg2的适宜浓度为1.5 ~ 2.0 mmol/L，如果Mg2的浓度过高，反应的特异性会下降，出现非特异性扩增。浓度过低，Taq DNA聚合酶活性下降，反应产物减少。

PCR反应条件的选择

PCR反应条件是温度、时间和循环次数。

温度和时间的设定：根据PCR原理的三个步骤，设定变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中，双链DNA在90 ~ 95变性，然后迅速冷却到40 ~ 60，引物退火并结合到靶序列上，然后迅速加热到70 ~ 75。在Taq DNA聚合酶的作用下，引物链沿着模板延伸。对于较短的靶基因(长度100 ~ 300 bp)，可采用双温点法。除了变性温度之外，退火和延伸温度可以合二为一。一般采用94变性，65左右退火延伸(Taq DNA酶在此温度下仍有较高催化活性)。

变性温度和时间：低变性温度和不完全熔化是主要原因

退火(复性)温度和时间：退火温度是影响PCR特异性的重要因素。变性后，通过快速冷却到40 ~ 60，引物和模板可以结合。因为模板DNA比引物复杂得多，所以引物和模板之间碰撞结合的几率比模板互补链之间的几率高得多。退火温度和时间取决于引物的长度、碱基组成和浓度，以及靶序列的长度。对于20个核苷酸和50% G C含量的引物，55是选择最佳退火温度的理想起点。引物的复性温度可以通过下面的公式帮助选择合适的温度：

Tm值(熔化温度)=4(摄氏度)+2(华氏度)

复性温度=Tm值-(5 ~ 10)

在Tm值允许的范围内，选择较高的复性温度可以大大降低引物与模板的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30 ~ 60秒，足以使引物与模板完全结合。

延伸温度和时间：Taq DNA聚合酶的生物活性；

7080时150个核苷酸/秒/酶分子

70时60个核苷酸/秒/酶分子

50时24个核苷酸/秒/酶分子

当温度高于90时，DNA合成几乎不可能。

PCR反应的延伸温度一般为70 ~ 75，常见温度为72。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间可以根据待扩增片段的长度来确定。1Kb以内的DNA片段一般1min就够了。3 ~ 4 KB的靶序列耗时3 ~ 4min；10Kb的放大需要延长到15min。过长的延伸会导致非特异性扩增带的出现。对于低浓度模板的扩增，延伸时间稍长。

循环次数循环次数决定了PCR扩增的程度。PCR循环的次数主要取决于模板DNA的浓度。一般循环次数在30 ~ 40次之间，循环次数越多，非特异性产物越多。

PCR反应特征

强PCR反应的特定决定因素是：

引物和模板DNA的特异性正确组合；

碱基配对原理；

Taq DNA聚合酶合成反应的真实性；

靶基因的特异性和保守性。

引物和模板的正确组合是关键。引物与模板的结合以及引物链的延伸遵循碱基配对的原则。聚合酶合成反应的忠实性和Taq DNA聚合酶的耐高温性使得反应中模板和引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，扩增的目的基因片段也能保持较高的准确性。通过选择特异性高、保守的靶基因区域，其特异性会更高。

高灵敏度PCR产物的产量呈指数级增长，待测初始模板可从微微克(pg=10-12g)扩增到微克(ug=10-6g)。可以从一百万个细胞中检测出一个目标细胞；在病毒检测中，PCR的灵敏度可以达到3 RFUs(空斑形成单位)；在细菌学中，最低检出率为3个细菌。

一种简单快速的PCR反应使用耐高温的Taq DNA聚合酶。反应液一次性加入后，在DNA扩增液和水浴锅中进行变性-退火-延伸反应，扩增反应一般在2 ~ 4小时内完成。扩增产物一般用电泳分析，不一定用同位素，没有放射性污染，易于推广。

标本纯度低，不需要分离病毒或细菌，培养细胞。粗DNA产物和总RNA可以用作扩增模板。可通过血液、体腔液、漱口液、毛发、细胞、活组织等临床标本的粗DNA扩增直接检测。PCR扩增产物分析

PCR产物是否是特异性扩增，结果是否准确可靠，一定要严格分析鉴别，才能得出正确的结论。PCR产物的分析可以根据不同的研究对象和目的采用不同的分析方法。

凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴化乙锭染色，紫外观察，初步判断产物的特异性。年代

聚丙烯酰胺凝胶电泳：6 ~ 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离效果优于琼脂糖，条带集中，可用于科学研究和检测分析。

限制性内切酶分析：根据限制性内切酶在PCR产物中的位置，采用相应的限制性内切酶和电泳分离片段。这种方法不仅可以鉴定产物，还可以对目的基因进行分型和研究变异性。

分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。

Southern印迹杂交：在两条引物之间合成另一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)，然后作为探针与PCR产物杂交。该方法不仅可用于特异性鉴定，还可提高PCR产物的灵敏度，并可获知其分子量和带型。主要用于科学研究。

点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后与内部寡核苷酸探针杂交，观察是否有有色斑点，主要用于PCR产物的特异性鉴定和变异分析。

序列分析：是检测PCR产物特异性的最好方法。

PCR是什么意思？实时荧光定量PCR (RTFQ PCR)是美国应用生物系统公司于1996年推出的一项新的定量检测技术。它通过荧光染料或荧光标记的特异性探针对PCR产物进行标记和追踪，实时在线监测反应过程，用相应的软件对产物进行分析，计算出待测样品模板的初始浓度。

pcr的检测是什么？聚合酶链式反应

点击具体内容：简称聚合酶链反应。聚合酶链反应(PCR)是一种体外酶促合成特定DNA片段的方法。它由高温变性、低温退火和温度适宜的延伸等几个步骤组成，形成一个循环，可以快速扩增目的DNA。具有特异性强、灵敏度高、操作简单、省时的特点。它不仅可以用于基因分离、克隆、核酸序列分析等基础研究，还可以用于疾病的诊断或任何有DNA、RNA的地方。聚合酶链式反应(PCR)也称为无细胞分子克隆或体外引物导向的特定DNA序列的酶促扩增。

什么是pcr检测聚合酶链反应(PCR)是20世纪80年代中期发展起来的一种体外核酸扩增技术。

上面这句话来自百度。

简单来说，这项技术就是DNA片段扩增技术。

有时候我们需要检测某个DNA片段的存在。

但是这个片段的量很小，直接检测的话不容易检测出来。

这时候就需要用pcr技术在体外扩增这个DNA片段，比如在EP管中。

比如像小号。如果你放大一个很小的声音，我们很容易就能听到。

经过PCR扩增后，我们想要检测的DNA片段数量增加了数百万倍，此时我们很容易检测到。

PCR扩增是指数级的。

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Pcr检查是什么聚合酶链式反应，简称PCR。英语聚合酶链反应(PCR)是一种体外酶促合成特定DNA片段的方法。它包括高温变性、低温退火和温度适宜的延伸等几个反应。从而使靶DNA迅速扩增。具有特异性强、灵敏度高、操作简单、省时的特点。它不仅可以用于基因分离、克隆、核酸序列分析等基础研究，还可以用于疾病的诊断或任何有DNA、RNA的地方。聚合酶链式反应(PCR)也称为无细胞分子克隆或体外引物导向的特定DNA序列的酶促扩增。由美国科学家PE(Perkin Elmer Perkin-Elmer)公司的Mullis博士发明，由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，Mullis获得了1993年的诺贝尔化学奖。

DNA的半保守复制是生物进化和传代的重要方式。双链DNA在各种酶的作用下可以变性，熔化成单链。在DNA聚合酶和启动子的参与下，它可以根据碱基互补配对的原理复制到同一个双分子壳中。实验中发现，DNA在高温下可以变性熔化，温度降低后可以重新折叠成双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，设计引物作为启动子，加入DNA聚合酶和dNTP，就可以完成特定基因的体外复制。

简单来说，我们用一个特殊的仪器，dNTPS，Mg2，特异性引物，DNA聚合酶和缓冲体系，加上一个模板，也就是一个DNA样本，进行体外扩增，结果就是电泳。如果扩增产物大小与目标条带一致，说明引物对模板具有特异性，检测指标为阳性。

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