激光共聚焦荧光显微镜原理(共聚焦显微镜的使用方法)

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欲善其事，必先利其器。要想用好共焦显微镜，不能光会操作。你永远成不了“共焦大师”。想要成为共焦大师，要了解原理。好了，我们开始吧。什么是荧光？荧光荧光现象是物质在光的照射下发出光的现象。，荧光是一种光致发光现象，荧光物质只有在光的照射下才能发光。否则就是其他发光现象而不是荧光。比如一种夜光物质，夜光表，虽然需要先用光照射，但离开光后还能继续发光，不是荧光。这叫做磷光。另一个例子是使用化学发光的蛋白质印迹，化学发光也是发光，但不是荧光。第二，荧光物质发出的荧光不同于照射光的颜色。准确地说，荧光物质的波长不同于照射光的波长。典型的荧光物质在紫外线照射下能发出黄绿色荧光。比如货币上的荧光防伪标记，经过紫外线照射后，可以变成黄色和绿色。所以用荧光显微镜的照片观察绿色荧光样品时，你会看到物镜下照射到样品上的光是蓝光。当观察红色荧光样品时，照亮样品的是绿光。在目镜中，你可以分别看到绿色和红色的荧光图像。在荧光显微镜中，样品被蓝光照射后，样品发出的绿色荧光与样品照射的蓝光混合，蓝光被滤光片滤除，目镜上只能看到绿色荧光。样品发出的荧光虽然有一种颜色，但不是单色光，而是具有一定波长分布范围的混合光。测量每个波长的相对光强，做出光强-波长的曲线，这就是荧光光谱。或发射光谱。它反映了这种物质发出的荧光的颜色组成。一般荧光物质的荧光光谱的波长范围不会太大，所以会形成一些明显的颜色。例如绿色或红色或黄绿色。通常这个波长范围是几十纳米。在荧光的光谱分布中，会有一个波长对应最强的荧光强度。这个波长就是我们通常所说的荧光波长，也叫最大发射波长。通常荧光染料参数中的荧光波长就是这个波长。荧光物质发出的光实际上是在这个波长上下几十纳米的范围内。照亮样品的光称为激发光。激发光的波长必须比荧光的波长短。这是能量守恒的一个因素。波长短的光能量高，只能激发能量较低的光。所以理论上只有波长比荧光短的光才能激发荧光。一种发出红色荧光的物质，可以被紫外光、蓝光、绿光激发发出红色荧光。，也有某种波长的光是最有效的。能激发出最强的荧光。这是最大激发波长。这也是荧光染料参数中激发光的波长。染料发出荧光，其颜色基本与激发光无关。即如果染料发出红色荧光，你可以用蓝光、紫外光、绿光激发红色荧光，只能激发红色荧光。从技术上讲，荧光的光谱与激发光无关。荧光光谱是样品在每个波长发出的荧光的强度分布。它的峰值是最大发射波长，或最大荧光波长。各种染料的荧光光谱基本都是这个形状，最大波长的简单峰，宽度几十纳米。所以荧光虽然不是纯单色光，但基本上是一种颜色。

与荧光光谱相比，激发光谱稍微复杂一些。一般不是一个简单的峰，有时有几个峰，宽度通常可以从紫外到荧光波长。这意味着在正常情况下，对于用什么光来激发有很大的容忍度。只要波长比荧光短，就能激发荧光。这是现在的显微镜，它的过滤系统和以前不一样。以前可以分别选择激发滤光片和发射滤光片，用蓝光激发红光。现在用的是滤光片组，用绿光激发红光。虽然可以用于大部分染料，但偶尔一个需要蓝光激发红光的也不会表白。除非你花上几千块买一个专门的过滤块。

激发光谱和发射光谱基本是分开的，没有重叠，所以两个光谱一般都画在一个图上，就是这个样子。两条曲线分别对应于激发光谱和发射光谱。

当使用两种染料时，通常分别拍摄红色和绿色荧光。使用红色滤镜拍摄红色荧光。这个时候其实会有一点点绿色荧光，滤镜无法完全滤除绿色荧光。拍绿色荧光的时候也会有一点红色荧光。当两种染料的荧光强度差不多时，其他荧光的泄漏对图像的影响很小。但如果两种染料的荧光强度相差太大，就会出现问题。例如，红色荧光强度为1000，绿色荧光强度为1，滤光效率为1%。用绿色滤光片观察时，绿色荧光强度为1，红色强度为1000X1%=10，泄漏的红光比绿光强。这时在镜子下可以看到红色的荧光，这就是串色现象。可以看出，解决串色的办法是在制样时降低强荧光染料的浓度，使两种颜色的亮度达到平衡。当两种染料的荧光颜色非常接近时，例如都是绿色荧光，但波长略有重叠而不是完全重叠，理论上可以将两种波长的荧光拍摄下来，然后通过计算将两种荧光分开。现在的光谱共焦显微镜就有这个能力。，制作两个单染样品，分别扫描它们的光谱，计算它们的校正系数。然后，用两种波长扫描双染样品的照片。根据系数计算图片，得到两张独立的图片。该功能在实际应用中可能无效。，两种荧光必须足够强，强度均衡，才能进行有效的计算。如果荧光较弱，计算误差会相当大，得不到好的结果。今天了解了原理之后，在下一期，我们将向您展示如何安装和使用共焦显微镜。请关注“使用共聚焦显微镜的技巧和经验”

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